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Western blot（WB）是一種檢測特定蛋白質(zhì)表達水平的實驗技術(shù)，跟我們小伙伴的實驗生活息息相關(guān)，但由于復(fù)雜的步驟，一不留神就做不出來，著實讓人頭疼。小編開了“干濕結(jié)合”專欄，“干濕結(jié)合”比純實驗周期更短，更容易出陽性結(jié)果，加鏈接，助力大家早日畢業(yè)，早日晉升！言歸正傳，以下是一些確保WB實驗順利進行的建議：

1 樣品準備：使用裂解緩沖液（如RIPA緩沖液）與蛋白酶抑制劑混合，確保樣品在4°C下裂解30分鐘。

2 蛋白定量：通過BCA法定量蛋白質(zhì)，確保每個樣品的蛋白質(zhì)濃度在1-2 mg/mL。

3 凝膠電泳：對于小分子蛋白（<50 kDa），使用10%聚丙烯酰胺凝膠；對于大分子蛋白（>50 kDa），使用6%聚丙烯酰胺凝膠，電泳電壓設(shè)為100V持續(xù)1-2小時。

4 轉(zhuǎn)膜：在4°C下，使用100 mA的恒定電流轉(zhuǎn)膜1-2小時。

5 封閉：使用5%脫脂奶粉或3%牛血清白蛋白（BSA）在室溫下封閉膜2小時。

6 一抗孵育：使用1:1000至1:5000稀釋的一抗，在4°C下孵育過夜（約16-18小時）。

7 二抗孵育：使用1:10000稀釋的二抗，在室溫下孵育1-2小時。具體稀釋倍數(shù)根據(jù)說明書來定。

8 洗滌：每次抗體孵育后，使用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次5分鐘。

9 曝光條件：使用化學(xué)發(fā)光底物進行曝光，曝光時間從1秒到5分鐘不等，根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整。

10 內(nèi)參控制：選擇β-actin或GAPDH作為內(nèi)參，上樣量通常為20-30 μg。

& 實驗前，把需要的試劑，耗材，拉個清單出來,比如這樣

I.Western blot溶液配制：

A.5× loading buffer

7ml stacking buffer（pH6.8）

5g SDS

1.2mg 溴酚藍

3ml 甘油

0.1ml 14.4mM belt-巰基乙醇

B.30 %丙烯酰胺液

29 %（w/v） 丙烯酰胺

1 % （w/v） N’N-亞甲基雙丙烯酰胺

C.seperating buffer

1.5 M Tris pH 8.8

D.stacking buffer

1.0 M Tris pH 6.8

E.10%AP

1g AP（過硫酸銨）

10ml H2O

F.脫色液

225ml 甲醇

225ml 乙醇

50ml 乙酸

500ml H2O

G.染色液

500ml H2O中加入2.5g考馬斯亮藍R-250，用抽濾的方法去除R-250中的雜質(zhì)，然后再加入225ml甲醇、225ml乙醇、50ml 乙酸

H.麗春紅

麗春紅S 2 g

三氯乙酸 30 g

磺基水楊酸 30 g

加ddH2O至100 ml

I.轉(zhuǎn)移緩沖液（10×）

Tris-base 30 g

Glycine 144 g

加ddH2O至1000 ml

轉(zhuǎn)移緩沖液（1×）

100ml 10×轉(zhuǎn)移緩沖液

200ml 甲醇

700ml H2O

J.電泳緩沖液（10×）

Tris-base 30.3 g

Glycine 144 g

SDS 10 g

加ddH2O至1000 ml

K.TBS（10×） pH=7.6

Tris-base 24.2 g

NaCL 80 g

加ddH2O至1000 ml

TBS-T（1×） pH=7.6

100ml TBS（10×） pH=7.6

895ml H2O

5ml 10%tween-20

L.顯影液

用250ml的燒杯盛約100mlH2O，微波爐加熱至50℃，將小包顯影液加入其中溶解，待完全溶解后，加水至1L，然后加入大包顯影液，混勻溶解后，分裝于棕色瓶中。

M.定影液

一包定影液放入1LH2O中，混勻溶解后，分裝于棕色瓶中。

N.striping buffer

2% SDS

100 mM beta-mercaptoethanol

50 mM Tris, pH 6.8