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細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)的過程。存在證據(jù)等級(jí)低的劣勢，但由于其來源容易獲取、有細(xì)胞特異性及實(shí)驗(yàn)周期短、成本低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。需要無菌無毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、恒定的細(xì)胞生長溫度(37°C)、合適的氣體環(huán)境(溶氧和二氧化碳)、適宜的pH及合適的細(xì)胞培養(yǎng)基。

一、細(xì)胞的類型

1、根據(jù)細(xì)胞的來源

（1）原代細(xì)胞(primary cell)：直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、器官或者組織分離出的第一代細(xì)胞。更接近于細(xì)胞的在體狀態(tài)和特性，但獲取及培養(yǎng)均較難。一般認(rèn)為，培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。在人工條件下使其原代細(xì)胞生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。

（2）細(xì)胞系(cell line)：是由原代細(xì)胞經(jīng)傳代成功后即為細(xì)胞系。細(xì)胞系泛指一般可能傳代的細(xì)胞，其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系。大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。如果不能繼續(xù)傳代，或傳代次數(shù)有限， 可稱為有限細(xì)胞系(finite cell line)， 如可以連續(xù)培養(yǎng)， 則稱為連續(xù)細(xì)胞系(continuous cell line)， 培養(yǎng)50代以上并無限培養(yǎng)下去。人類腫瘤細(xì)胞，在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。

（3）細(xì)胞株(cell strain)：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)細(xì)胞中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞稱為細(xì)胞株。一般認(rèn)為，細(xì)胞株是用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。

2、根據(jù)生長方式

（1）貼壁細(xì)胞

（2）懸浮細(xì)胞

（3）半貼壁半懸浮細(xì)胞

正常細(xì)胞形態(tài)較好，輪廓清晰，邊緣透亮，細(xì)胞增殖狀況良好。當(dāng)貼壁細(xì)胞長到密度90%時(shí)，需進(jìn)行傳代。

3、無菌原則

（1）操作臺(tái)環(huán)境無菌：紫外線消毒至少30分鐘，75%酒精擦拭。

（2）實(shí)驗(yàn)材料無菌：紫外線照射、酒精擦拭、酒精燈、封口膜。

（3）實(shí)驗(yàn)時(shí)手部無菌。

（4）實(shí)驗(yàn)操作無菌。

二、維持細(xì)胞生長的試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：必需成分為氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、緩沖體系。

三、常見問題解答

1：要怎么樣復(fù)蘇細(xì)胞?

答：細(xì)胞復(fù)蘇需要準(zhǔn)備一個(gè)37℃水浴鍋、手套、鑷子，以及防護(hù)眼鏡。戴上手套，用鑷子夾住液氮罐中拿出的凍存管，然后快速在37℃水浴鍋里融解細(xì)胞。防護(hù)眼鏡可以防止液氮罐里剛剛拿出來的管子液氮爆炸。

2：培養(yǎng)基不夠用，我能不能換一下細(xì)胞培養(yǎng)基啊?

答：不能，更換培養(yǎng)條件，細(xì)胞可能無法快速適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3：復(fù)蘇后應(yīng)不應(yīng)該立馬去除掉DMSO?

答：有一些細(xì)胞會(huì)對DMSO，一般的培養(yǎng)條件來說，復(fù)蘇后的細(xì)胞(含有DMSO)加入完全培養(yǎng)基后培養(yǎng)，一天后再換液，可以避免復(fù)蘇后細(xì)胞的生長和粘附的問題。

4：什么時(shí)候需要換液?

答：這個(gè)要根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)來定，當(dāng)細(xì)胞代謝加快后，應(yīng)該換液。細(xì)胞密度增大后，需要考慮傳代。

5：培養(yǎng)基到底要不要加抗生素?

答：其實(shí)是不推薦加抗生素的，但是很多時(shí)候，都會(huì)為了保險(xiǎn)，加上雙抗。但雙抗只能抗細(xì)菌，不能抗真菌!

6：啥時(shí)候用5%的CO2，啥時(shí)候用10%的CO2呢?

答：主要看的是培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基的緩沖體系基本上都是用碳酸氫鈉緩沖體系的，培養(yǎng)基里的碳酸氫鈉的濃度決定了CO2的量，當(dāng)碳酸氫鈉達(dá)到3.7g/L的時(shí)候，需要采用10%的CO2，當(dāng)碳酸氫鈉達(dá)到1.5g/L的時(shí)候，需要用5%的CO2。如果你用的培養(yǎng)基用的是Hank's balanced salt solution (HBS，Hank緩沖液)的話，就不能用CO2培養(yǎng)箱了，因?yàn)檫@個(gè)體系里碳酸氫鈉濃度只有0.35g/L。

7：培養(yǎng)基在冰箱里的時(shí)候，紫紅色的培養(yǎng)基為啥會(huì)變暗?

答：培養(yǎng)基沒有密封好保存，因?yàn)楸淅餂]有CO2補(bǔ)充，培養(yǎng)基變成堿性，顏色就暗了。

8：支原體污染是否能肉眼識(shí)別?

答：支原體用肉眼基本很難判別，主要還是通過PCR檢測或者是染色檢測來區(qū)分支原體污染與否的。

9：細(xì)胞離心的話要怎么離心?

答：推薦1000rpm離心5-10分鐘，這樣比較不容易傷害細(xì)胞。

10：復(fù)蘇后的細(xì)胞死亡率高是啥原因?

答：1)培養(yǎng)基質(zhì)量差，2)質(zhì)量差，3)復(fù)蘇后立馬離心，導(dǎo)致大量細(xì)胞原地爆炸，3)細(xì)胞長時(shí)間放置在-80℃，4)誤把懸浮細(xì)胞當(dāng)做是死細(xì)胞。

11：培養(yǎng)基里L(fēng)-谷氨酰胺是干嘛用的?

答：L-谷氨酰胺的主要作用是在培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)合成和核酸代謝。

12：培養(yǎng)基里的酚紅是干嘛用的?

答：酚紅一般作為培養(yǎng)基中pH值的指標(biāo)：當(dāng)培養(yǎng)基呈中性時(shí)為紅色，呈酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。另外，酚紅可以模擬類固醇激素(特別是雌激素)的作用。如果要避免類固醇反應(yīng)，可以在無酚紅的培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)。