RM新时代平台网址

qPCR(實時熒光定量PCR)是在傳統(tǒng)PCR基礎上加入熒光信號，實時PCR擴增進行檢測。它不僅繼承了傳統(tǒng)PCR高靈敏度和操作簡便的特點，而且實現(xiàn)了對樣本的定量檢測，重要的是，qPCR降低了系統(tǒng)的檢測Z低限，使其比普通PCR的靈敏度高出1-2個數(shù)量級。

根據(jù)信號基團的不同，qPCR可以分為染料法和探針法。探針法利用熒光探針實時監(jiān)測PCR反應過程中的DNA合成情況，定量檢測樣品中的目標序列，可以很好地解決染料法中存在的非特異性問題。

當下，有多種類型的探針可用于qPCR，不同的探針通過使用不同的熒光基團能發(fā)出不同波長的熒光。常見的探針包括TaqMan探針、雙雜交探針、分子信標、MGB探針、蝎形探針、雙淬滅探針和LNA探針等

一、TaqMan探針

TaqMan探針是一種雙標記的水解探針，包括一個序列特定的寡核苷酸、5’端標記熒光基團(如FAM、HEX)，3’端標記熒光淬滅基團(如TAMRA、BHQ)。探針完整時，淬滅基團會抑制熒光信號。在目標擴增過程中，Taq酶會裂解結合目標序列的探針，從而使得熒光基團與淬滅基團分離，釋放熒光信號。

TaqMan探針因為其特異性好、結果可靠、成本低廉，成為qPCR中，Z常用的探針類型。

二、雙雜交探針

與TaqMan探針不同，雙雜交探針的供體基團和受體基團分別在兩個探針上，兩個探針都可以與擴增產物雜交，雜交位置不同但非常接近。反應過程中，兩個探針在擴增產物上雜交探針熒光，一頭一尾。雜交后兩組距離在10 nm以內(一般為1-5個堿基)。這時受體基團會發(fā)出熒光。

由于兩個不同的探針必須雜交到正確的靶序列時，才能檢測到熒光。因此，該方法的特異性較TaqMan探針更強。

三、分子信標

分子信標是在TaqMan探針的基礎上改良的。在TaqMan探針寡核苷酸與基團的連接處，各增加了5-6個互補堿基，形成一個發(fā)卡結構，使熒光基團與淬滅基團靠近并淬滅熒光信號。當探針與目標序列結合時，發(fā)卡結構打開，熒光基團與淬滅基團遠離，從而產生熒光信號。

相比較于普通探針，分子信標特異性更強，能夠準確區(qū)分靶標序列，檢測單堿基突變，是遺傳篩選、SNP檢測和藥物遺傳學應用的診斷測定的理想探針。

四、MGB探針

MGB(小凹槽結合劑)探針和TaqMan探針一樣，在兩端有熒光基團和淬滅基團。不同的是，在淬滅基團附近有一個MGB，在探針未結合目標序列的情況下，MGB探針隨機地盤繞，使熒光基團接近。探針結合目標序列時，MGB幫助探針線性化，熒光基團發(fā)光。

MGB的結合一方面可以很大程度上提高探針的Tm值，增加雜交反應的特異性，另一方面能夠消除傳統(tǒng)淬滅探針產生的熒光背景，提高信噪比，從而提高檢測靈敏度。這些特性決定了MGB探針非常適合單堿基突變的檢測(SNP分型)。

五、蝎形探針

蝎形探針的探針部分與分子信標探針相似，也是5’端標記熒光基團，3’端標記熒光淬滅基團，并且形成發(fā)卡結構。與之不同的是，蝎形探針帶有一段與引物結合位點下游和擴增子內區(qū)域相匹配的序列，并且其3’端通過PCR blocker(一個非擴增的單體，防止探針退火后延伸)與PCR引物相連。反應變性階段發(fā)卡結構打開，退火時引物與模板結合并延伸，發(fā)卡區(qū)與新合成的目的基因的互補區(qū)域結合。PCR得到的產物和蝎形探針是一個分子，探針的雜交是在分子內，沒有兩個分子的參與，從而使雜交反應更迅速有效。

蝎形探針適用多種核酸檢測領域。如基因突變檢測、病毒RNA/DNA檢測和細胞診斷等。

六、雙淬滅探針

雙淬滅探針與普通探針基本工作原理一致，主要區(qū)別是在探針內部額外添加第二個淬滅基團。隨著探針長度的增加，單淬滅探針的淬滅效果逐漸變差，雙淬滅探針應運而生。傳統(tǒng)探針的熒光基團與淬滅基團之間有大約 20~30 個堿基，而內置ZEN淬滅基團將這一距離縮短到了只有 9 個堿基。距離縮短能使淬滅更徹底、本底更低，特別是在與傳統(tǒng)的 3′ 端淬滅基團相結合時，同時能夠在富含 AT 的目標區(qū)域使用更長的探針進行設計。除了顯著降低本底外，與傳統(tǒng)探針相比，雙淬滅探針還能提供更低的 Ct 值和更高的精準度。

ZEN 雙淬滅探針含有一個 5′ 端熒光基團；3′ Iowa Black FQ (IBFQ) 淬滅基團；以及專有的內置 ZEN 淬滅基團。Z常用的 5′ 端熒光基團包括 FAM、TET或 HEX。

因此，雙淬滅探針適合替換長度大于25 nt的普通探針，或背景信號高的qPCR試驗。

七、LNA探針

LNA(鎖核酸)是一類經(jīng)過修飾、含有亞甲基橋的修飾核苷酸，能夠限制核糖結構的靈活性。由于LNA與DNA/RNA在結構上具有相同的磷酸鹽骨架,故其對DNA、RNA有很好的識別能力和強大的親和力。

在探針序列中加入LNA可以提高探針的特異性，便于使用較短的qPCR探針，適合一些特殊序列。

這些探針類型在qPCR中扮演著不同的角色，選擇合適的探針取決于實驗設計、靶標的特性以及需要的靈敏度和特異性。在實際操作中，科研人員根據(jù)具體的研究需求和PCR反應的特點選擇Z合適的探針類型。