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蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot, WB）是一種檢測特定蛋白表達(dá)量的實驗。以下是簡要的實驗步驟（詳細(xì)步驟和操作見圖）：

1、配置SDS-PAGE膠

10%分離膠：混合ddH2O 7.9ml、30%丙烯酰胺6.7ml、1.5M Tris-HCl pH 8.8 5.0ml、10% SDS 200μl、10% 過硫酸銨200μl和四乙基乙二胺8μl，倒入玻璃板中，靜置凝固。

濃縮膠：混合ddH2O 4.1ml、30%丙烯酰胺1.0ml、1.0M Tris-HCl pH 6.8 0.75ml、10% SDS 60μl、10% 過硫酸銨60μl和四乙基乙二胺6μl，倒入已凝固的分離膠上，插入梳子。

2、蛋白質(zhì)電泳SDS-PAGE

電泳液：按Tris 3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g和ddH2O 1000mL比例配置。

上樣：拔出梳子，向孔中加入蛋白樣品或marker。

電泳：恒壓80V啟動，蛋白進(jìn)入分離膠后調(diào)至120V，電泳至適當(dāng)位置停止，以自己需要的Z小蛋白沒有跑到底為準(zhǔn)。

3、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜液：1×轉(zhuǎn)膜液由100ml 10×轉(zhuǎn)膜液(Tris 3.03g、甘氨酸18.77g和ddH2O 1000mL)、200ml無水甲醇和700ml ddH2O配置。

激活PVDF膜：在醇類中浸泡至半透明。

轉(zhuǎn)膜：將凝膠轉(zhuǎn)移到三明治夾上，覆蓋激活的PVDF膜，冰上300mA恒流轉(zhuǎn)膜120分鐘（具體時間根據(jù)分子量大小調(diào)整）。

4、封閉及抗體孵育

TBST：由10×TBS（Tris 24.23g，NaCl 80.06g，ddH2O 1000ml）、去離子水、吐溫和適量鹽酸配置，調(diào)節(jié)至pH約7.4。

封閉：PVDF膜浸泡于含5%BSA或脫脂奶粉的TBST中1小時。

一抗孵育：TBST洗滌后，浸泡于一抗中，4℃過夜。

二抗孵育：TBST洗滌，配置含5%BSA或脫脂奶的TBST二抗，室溫孵育1小時，TBST洗滌。

5、化學(xué)發(fā)光檢測

化學(xué)發(fā)光液：A液和B液按1:1混合，均勻淋于膜表面。

曝光：將膜放置于化學(xué)發(fā)光儀中，根據(jù)需要調(diào)整曝光時間。