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2024-08-28 14:00:29
作者: 高思維醫(yī)療
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細胞表型乃是涵蓋基因及蛋白表達的多個細胞進程的聚合體,此類進程致使細胞具有特定的形態(tài)與功能。細胞表型的檢測,所檢測的乃是如下一系列表型:周期、增殖、凋亡、遷移、侵襲、克隆形成、自噬、EMT(上皮間充質轉化)、血管生成。于細胞內部,將某一目的基因進行敲除、敲降、過表達,構建穩(wěn)轉株之后,與對照細胞一同,展開細胞表型的檢測,察看每一項表型的變化,便可推斷出該目的基因的功能。
1、細胞周期
細胞周期是指細胞從一次分裂結束開始,到下一次分裂結束所經(jīng)歷的過程。細胞周期包括以下幾個階段:G1 期:細胞生長和合成代謝活躍的時期,為進入 S 期做準備。S 期:進行 DNA 合成的階段。G2 期:進一步合成細胞所需物質,為分裂做準備。M 期:即有絲分裂期,細胞發(fā)生染色體分離和胞質分裂。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,可透過凋亡中晚期的細胞和死細胞,嵌入核酸DNA或RNA雙鏈螺旋的堿基之間,使細胞核紅染,并且熒光強度和所嵌入的核酸含量成正比。細胞周期檢測時,首先用RNA 酶將RNA消化排除影響,通過流式細胞術檢測PI熒光強度直接反映細胞各時相的DNA分布狀態(tài),從而計算出各時相的百分率。
2、細胞增殖
細胞增殖實驗是一類用于評估細胞生長和分裂能力的實驗方法。檢測增殖情況研究細胞的生長特性和生物學行為,評估藥物或其他處理因素對細胞增殖的影響,篩選具有增殖調節(jié)作用的化合物,了解細胞信號通路和基因調控對增殖的作用。通常細胞達到飽和密度后,停止生長,進入平臺期,然后退化衰亡??梢杂么婊罴毎麛?shù)(萬/mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖,得到生長曲線,可準確描述整個過程中細胞數(shù)目的動態(tài)變化。目前主要使用MTT、CCK8和Am-blue三種試劑測定細胞生長曲線。
3、細胞遷移
細胞遷移指的是細胞在接納到遷移信號或是感知到某些物質的梯度后所出現(xiàn)的移動。細胞遷移為細胞頭部偽足的延展、新的黏附建立以及細胞體尾部收縮于時空上交互進行的過程。細胞遷移作為正常細胞的一項基本功能,屬于機體正常生長發(fā)育的生理流程,亦是活細胞廣泛存在的一種運動形式。在胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、免疫反應、炎癥反應、動脈粥樣硬化以及癌癥轉移等過程里均涵蓋了細胞遷移。檢測細胞遷移能力的實驗包含劃痕實驗與 Transwell 實驗。細胞劃痕實驗即于體外培養(yǎng)皿抑或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上,借助微量槍頭或者其他硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃出線條,去除中央部位的細胞,接著持續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設定的時間,對細胞進行觀察。Transwell 的基本原理為把 transwell 小室放置于培養(yǎng)板中,小室被稱作上室,培養(yǎng)板內則稱為下室,上下層培養(yǎng)液通過聚碳酸酯膜相隔,在上室內添加上層培養(yǎng)液,下室內添加下層培養(yǎng)液。將細胞種植在上室內,鑒于膜具有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分能夠作用于上室內的細胞,如此便能研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。
4、細胞侵襲
細胞侵襲實驗的目的是研究趨化因子或其他營養(yǎng)物質對細胞侵襲的影響。將細胞種于上室,趨化因子等種于下室,細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑。與遷移實驗不同是侵襲實驗需要在小室聚碳酸酯膜上鋪設一層基質膠。用以模仿體內細胞外基質,細胞欲進入下室,先要分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)將基質膠降解,方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。
5、細胞凋亡
細胞凋亡是指在特定的生理或病理狀況下,細胞依照自身的程序,自行終結其生命的過程。這是一個主動、高度有序且由基因控制,并有一系列酶參與的過程。磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)通常處于細胞膜的內側,然而在細胞凋亡的初期,PS 會從細胞膜的內側翻轉至細胞膜的表面,展露在細胞外的環(huán)境當中。把標記有熒光素或者 biotin 的 Annexin V(一種 Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,與 PS 具有高親和力且能特異性結合)與 PC 結合,通過流式細胞儀或者熒光顯微鏡,就能夠檢測到細胞凋亡的發(fā)生。將 Annexin V 與 PI 配合使用,便可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞予以區(qū)分。
6、細胞自噬
細胞自噬是通過溶酶體進行蛋白降解和細胞組分調節(jié)的過程。自噬主要受細胞內的營養(yǎng)匱乏刺激而產生,在生物體內發(fā)育、分化、環(huán)境脅迫和腫瘤發(fā)生中具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)微管相關蛋白輕鏈3(MAP-LC3),簡稱LC3,參與了自噬的形成,并被證明了是哺乳動物細胞中常見的自噬小體標記蛋白之一??稍诩毎斜磉_LC3-GFP融合蛋白,對自噬體的形成和功能進行監(jiān)控。細胞自噬的調節(jié)機制復雜,受到多種信號通路和分子的調控。細胞自噬作用:物質循環(huán)和能量利用:分解和回收細胞內的多余或受損成分,提供能量和物質。細胞穩(wěn)態(tài)維持:清除異常蛋白質、細胞器等,保持細胞內環(huán)境穩(wěn)定。應激適應:在應激條件下,如營養(yǎng)缺乏、缺氧等,提供生存所需的物質和能量。免疫調節(jié):參與免疫應答,清除病原體。腫瘤發(fā)生:與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。因此,可在相關疾病研究中檢測自噬,研究基因功能。
7、EMT
EMT,指上皮細胞-間充質轉化的縮寫,是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。通過Western Blot的方法檢測細胞中目的基因敲降或過表達后EMT marker蛋白表達量,可判斷目的基因表達變化后是否能抑制EMT過程的發(fā)生,從而判斷該基因是否為轉移相關基因。




