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伯樂(lè)（Bio-Rad）ChemiDoc 凝膠成像系統(tǒng)（特別是 ChemiDoc MP 型號(hào)，因?yàn)橹挥卸酂晒庑吞?hào)才涉及此問(wèn)題），多通道熒光串?dāng)_是一個(gè)在實(shí)際操作中需要關(guān)注的技術(shù)現(xiàn)象。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)：串?dāng)_是指一個(gè)熒光通道（如綠色）檢測(cè)到了本應(yīng)屬于另一個(gè)通道（如紅色）的熒光信號(hào)。

一、為什么會(huì)發(fā)生串?dāng)_？

1、光譜重疊：這是根本原因。不同熒光染料的發(fā)射光譜可能存在重疊區(qū)域。例如，Cy3（綠色通道檢測(cè)）和 Cy5（紅色通道檢測(cè)）的發(fā)射峰距離較遠(yuǎn)，但某些染料的尾部發(fā)射會(huì)延伸到其他通道的檢測(cè)范圍內(nèi)。

2、濾光片帶寬：ChemiDoc MP 使用的是特定的激發(fā)光LED和發(fā)射濾光片。濾光片無(wú)法實(shí)現(xiàn)“單色”透過(guò)，總有一定帶寬。如果濾光片帶寬覆蓋了其他染料的發(fā)射范圍，就會(huì)產(chǎn)生串?dāng)_。

3、強(qiáng)信號(hào)放大效應(yīng)：當(dāng)某一個(gè)通道的熒光信號(hào)非常強(qiáng)時(shí)，其微弱的尾部發(fā)射即使比例很小，也可能在另一個(gè)通道中被明顯看到。

二、不同型號(hào)情況不同

1、ChemiDoc MP（真正多熒光成像）：這是能進(jìn)行多通道熒光成像的型號(hào)（支持RGB+遠(yuǎn)紅，Z多4通道）。它會(huì)有串?dāng)_問(wèn)題，但系統(tǒng)內(nèi)置了校正功能。

2、ChemiDoc XRS+ / Touch（基礎(chǔ)熒光型號(hào)）：這些型號(hào)通常只標(biāo)配一個(gè)紫外激發(fā)透射臺(tái)和一個(gè)白光/藍(lán)光轉(zhuǎn)換屏，主要用于單通道熒光（如EB，GelGreen）或化學(xué)發(fā)光。它們不能做多通道熒光成像，因此不存在不同熒光通道間的串?dāng)_問(wèn)題。如果你強(qiáng)行換濾光片做多色，需要手動(dòng)處理。

三、如何解決 ChemiDoc MP 的串?dāng)_問(wèn)題？

Bio-Rad 在 Image Lab 軟件 中提供了兩種有效的解決方案：

1、使用“串?dāng)_校正”（Crosstalk Correction）- 推薦常規(guī)使用

這是軟件內(nèi)置的自動(dòng)功能，利用純單染對(duì)照樣品計(jì)算校正矩陣。

操作步驟

（1）準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)樣品相同的單染對(duì)照（例如：只含GFP的樣品、只含RFP的樣品、只含Cy5的樣品）。

（2）將單染對(duì)照放入系統(tǒng)，用相同的多通道采集程序分別成像。

（3）在 Image Lab 軟件的分析界面中，找到 “串?dāng)_校正” 或 “通道拆分校正” （具體位置可能在“圖像處理”或“分析設(shè)置”中）。

（4）軟件會(huì)根據(jù)單染對(duì)照的信號(hào)，自動(dòng)計(jì)算各通道的串?dāng)_比例，并應(yīng)用補(bǔ)償算法，輸出校正后的圖像。這個(gè)功能非常有效，可以將串?dāng)_降低至背景水平。

2、手動(dòng)選擇“非重疊”的染料組合

如果不需要自動(dòng)校正，可以從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上避免串?dāng)_。選擇光譜分離度好的染料。

推薦組合

（1）通道1 (Green)：FITC，GFP，Alexa 488

（2）通道2 (Red)：Cy3，Alexa 546

（3）更好的選擇：使用 Cy5 (遠(yuǎn)紅通道) 與 GFP (綠通道) 組合，它們的重疊遠(yuǎn)小于 GFP 和 Cy3。

（4）同時(shí)使用 GFP 和 YFP（黃色熒光蛋白）- 光譜幾乎重疊。

（5）同時(shí)使用 Cy3 和 TRITC - 發(fā)射光譜太接近。

3、調(diào)整曝光時(shí)間

如果某個(gè)通道信號(hào)過(guò)強(qiáng)（過(guò)飽和），其串?dāng)_會(huì)顯著增加。嘗試縮短強(qiáng)信號(hào)通道的曝光時(shí)間，或增加弱信號(hào)通道的曝光時(shí)間，但后者的串?dāng)_效應(yīng)會(huì)更明顯。

四、總結(jié)建議

1、ChemiDoc XRS+ / Touch 做化學(xué)發(fā)光或單色熒光

是否串?dāng)_：無(wú)（不涉及多通道）

解決方案：無(wú)需處理

2、ChemiDoc MP 做多通道熒光

是否串?dāng)_：有，但可校正

解決方案：制備單染對(duì)照，在 Image Lab 軟件中執(zhí)行 “串?dāng)_校正”

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：優(yōu)先選擇 GFP + Cy5 這類(lèi)遠(yuǎn)距離組合，避免 GFP + Cy3

重要的提醒：不要試圖手動(dòng)扣除背景或使用“圖像相減”來(lái)校正串?dāng)_。光譜串?dāng)_是非線性的，必須使用軟件內(nèi)置的基于矩陣的校正算法。查看 Image Lab 軟件幫助文檔中的“Multiplex Fluorescence”章節(jié)，那里有詳細(xì)的操作截圖。