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疾病研究及藥物研發(fā)類實驗室常常涉及到功能蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析及蛋白質(zhì)間相互作用的分析。比如在科研中對蛋白純化、結(jié)晶和功能鑒定中要選擇Z大程度穩(wěn)定蛋白的配體或緩沖條件；科研或工業(yè)上選擇蛋白的Z佳儲存條件；藥物開發(fā)中對配體或藥物靶點進(jìn)行高通量篩選。針對以上研究領(lǐng)域，一種穩(wěn)定高效高通量的研究方法正在被相關(guān)研究者廣泛采用，即FRET蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析。

Bio-Rad針對蛋白熱穩(wěn)定性分析實驗，提供完整的解決方案。該方案采用差示掃描熒光(differential scanning fluorimetry,DSF)技術(shù)：反應(yīng)體系中加入熒光疏水染料Sypro Orange，蛋白自有疏水區(qū)結(jié)構(gòu)，在緩慢升溫的過程中，蛋白的結(jié)構(gòu)會被打開，暴露出疏水區(qū)，熒光疏水染料Sypro Orange就可以與該區(qū)域進(jìn)行特異性結(jié)合，設(shè)備提供該反應(yīng)的溫度變化及熒光信號采集，類同于熒光定量pcr反應(yīng)。

DSF技術(shù)原理

在有特定化合物或配體結(jié)合的情況下，蛋白穩(wěn)定性會發(fā)生變化，表現(xiàn)為熔解溫度的變化。不同蛋白將有著不同的thermal shift（蛋白熱熔解曲線）圖像，每一個都有獨特的熔解曲線形狀、斜率和溫度熔解范圍。據(jù)此特性，可借助熒光定量PCR儀來進(jìn)行該實驗。前提是熒光定量PCR儀具備Sypro Orange特異的激發(fā)檢測通道。

Bio-Rad Opus系列熒光定量PCR儀自帶專用檢測通道FRET，激發(fā)光波長450-490nm，發(fā)射光波長560-580nm，正適合于用SYPRO Orange熒光染料標(biāo)記進(jìn)行蛋白溶解曲線分析。在熒光定量PCR儀上緩慢加熱蛋白質(zhì)樣品,在加熱的過程中檢測熒光染料與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的蛋白質(zhì)相結(jié)合的量,來評價蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性.該方法具有數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,高通量,蛋白質(zhì)樣品損耗較小和溫度變化范圍廣的優(yōu)點,應(yīng)用領(lǐng)域包含：

1、篩選樣品蛋白熱穩(wěn)定性；

2、高通量篩選配體與蛋白的結(jié)合；

3、篩選能與蛋白靶點結(jié)合的小分子、片段文庫候選藥物；

4、篩選能與蛋白靶點結(jié)合的抗體；

5、篩選點突變后樣品的蛋白穩(wěn)定性變化；

6、尋找合適/Z佳緩沖液條件，以測定蛋白與配體間相互作用；

7、尋找合適緩沖液條件，以改善蛋白的純化、分離；

8、篩選合適/Z佳緩沖液，以鑒定成功的蛋白結(jié)晶條件；

9、篩選緩沖液，以鑒定出蛋白的Z佳儲存條件。