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那什么是非特異性擴增呢？且聽小編慢慢嘮。聚合酶鏈式反應（PCR）過程中可能而且經(jīng)常會遇到非特異性擴增的問題，就是PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的目的基因片段大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。如圖所示。

那為什么會出現(xiàn)非特異性擴增呢？首先小友帶您先了解一下PCR的原理。聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）是在體外模擬生物體內(nèi)的DNA復制過程，得到大量復制DNA。DNA體內(nèi)復制依據(jù)的是DNA的半保留復制，DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。過程是：雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入特異性引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。因此PCR 反應中的5個主要組分包括：模板（PCR起始原料）、特異性引物（與模板互補的寡聚核苷酸）、dNTPs（單個的脫氧核苷酸(A, C, T, G)）、DNA聚合酶（在延伸過程中加入dNTP）和PCR 緩沖液和輔助因子（提供酶反應的化學反應環(huán)境），缺一不可。標準的PCR過程分為三步：變型、退火、延伸。經(jīng)過30個PCR循環(huán)后，1個雙鏈DNA就變成了230個雙鏈DNA。原理圖如下：

非特異性條帶的出現(xiàn)，究其原因有兩個大的方面，原因一：PCR反應成分不合適，包括不限于引物不純、引物濃度過高、引物與靶序列不完全互補或引物聚合形成二聚體、dNTPs不純、鎂離子濃度過高、DNA聚合酶質(zhì)量不好或酶含量過高、模板不純、ddH2O有污染等等，原因二：PCR反應條件不合適，包括不限于退火溫度過低、退火時間過長、PCR循環(huán)次數(shù)過多、延伸時間過長，計算Tm值不正確等等。

改善非特性擴增的程序有很多，今天小友先給大家介紹一種特殊的程序，Touch Down PCR，Touch Down PCR 是對 PCR 的一種改進，是一種通過從高退火溫度開始并在 PCR 循環(huán)中緩慢降低退火溫度直至達到所需退火溫度來限制非特異性擴增的技術。Touch Down PCR 來克服非特異性擴增和引物二聚體形成的問題。Touch Down PCR 初始退火溫度一般設置為高于計算的引物退火溫度 (Tm)5-10℃，再比較高的退火溫度下，有利于引物-模板互補性Z高的擴增子的形成且積累；然后在后續(xù)循環(huán)中逐漸降低，直到達到Z佳退火溫度 Tm 。在低退火溫度下，理論上容易產(chǎn)生非特性擴增，但因為前期反應中產(chǎn)生了互補性Z高的擴增子（目的條帶），形成模板競爭優(yōu)勢來防止非特性擴增，這些目的條帶擴增子勝過任何非特異性產(chǎn)物或引物二聚體。

以BioRad T100為例，展示TouchDown PCR程序設置：程序如下，選中退火溫度，點擊Option選項，在Increment △temp/cycle選項框里輸入-0.5℃，點OK，每循環(huán)溫度變化設置完成，退火溫度出現(xiàn)溫度計圖標表示設置成功。此外，T100還能設置延伸時間不同的TouchDown PCR程序。除了TouchDown PCR之外，還可以設置梯度PCR，改變升降溫速率等等，BioRad各型號PCR儀及qPCR儀均支持這些程序的設置。