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你了解實驗室中蛋白酶抑制劑的作用和原理？

01蛋白酶抑制劑

蛋白酶抑制劑的作用是什么？

蛋白質(zhì)純化、提取過程中常受到其本身存在的水解酶的影響。在提取蛋白質(zhì)的過程中細(xì)胞破碎釋放出蛋白酶，這些酶在與欲提取的蛋白質(zhì)接觸時，一旦條件適宜，就會發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解。因此，在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加人蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)水解以保持蛋白質(zhì)的完整性。

蛋白酶抑制劑的作用原理是什么？

蛋白酶抑制劑（protease inhibitor）從廣義上指與蛋白酶分子活性中心上的一些基團(tuán)結(jié)合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白變性的物質(zhì)。

蛋白酶抑制劑有哪些使用條件？

1. 因為各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的性相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。

2. 由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，應(yīng)注意在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑時應(yīng)充分混勻，以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。

常用的蛋白酶抑制劑有哪些？

1.苯甲基磺酰氟化物( PMSF)

①抑制絲氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶)和巰基蛋白酶(如木瓜蛋白酶)，不抑制金屬蛋白酶及大部分半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶;

②溶于異丙醇、乙醇、甲醇、1, 2-丙二醇。在水溶液中不穩(wěn)定，在100%異丙醇內(nèi)，259℃穩(wěn)定;

③在室溫下可保存一年;

④工作濃度: 0. 1 ~ 1. 0mmol/L;

⑤在水溶液中不穩(wěn)定，必須在每一次分離和純化步驟中加人新鮮的PMSF。

2.乙二胺四乙酸鈉( EDTA-Na2 )

①抑制金屬蛋白水解酶;

②溶于pH 8 ~9的水中，溶液濃度約0.5mol/L; .

③溶液在4℃下可穩(wěn)定6個月以上;

④工作濃度: 0.2 ~ 1.5mmol/L;

⑤需加入NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH，否則EDTA不溶解。

3.胃蛋白酶抑制劑

①抑制酸性蛋白酶(如胃蛋白酶)、血管緊張肽原酶、組織蛋白酶L和凝乳酶;

②1mg/mL溶于甲醇中，不溶解于水;

③儲存液在4℃下一周內(nèi)穩(wěn)定，-209℃下可穩(wěn)定6個月;

④工作濃度：0. 7 ~ 1 μmol/L。

4.亮抑蛋白酶肽

①抑制絲氨酸和巰基蛋白酶，如木瓜蛋白酶、血漿酶和組織蛋白酶B;

②10mg/mL溶于水;

③儲存液4C下穩(wěn)定一周，- 20°C下可穩(wěn)定6個月;

④工作濃度：0. 5mg/mL。

5.胰蛋白酶抑制劑

①抑制絲氨酸蛋白酶( 如血漿酶)、血管舒緩素、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;

②10mg/mL溶于水，pH 7~8，在pH>12.8時失活;

③儲存液4°C下穩(wěn)定一周，-209°C下可穩(wěn)定6個月，避免反復(fù)凍融;

④工作濃度：0. 01 ~ 0.3μmol/L。.

6.抑胃肽

①抑制天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶)、腎素、組織蛋白酶D、凝乳酶和很多微生物的酸性蛋白酶;

②溶于甲醇，約1mg/mL,也可溶于乙醇或6mol/L乙酸(約300ug/mL)，不溶于水，4°C下至少一周內(nèi)穩(wěn)定;

③工作濃度: 0. 7μg/mL。

7.胱蛋白酶抑制劑

①抑制半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、組織蛋白酶B和二肽酰肽酶;

②將500μg胱蛋白酶抑制劑溶解于含20%甘油的重蒸水中，-20°C冷凍，兩個月內(nèi)穩(wěn)定;

③工作濃度: 250μg/ mL。

02磷酸酶抑制劑

蛋白酶抑制劑的作用是什么？

細(xì)胞或組織裂解時會釋放出大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，從而影響后續(xù)的蛋白檢測。因此在提取物中適量添加外源性磷酸酶抑制劑，有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀檢測磷酸化蛋白質(zhì)和蛋白激酶活性測定等實驗過程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。

蛋白酶抑制劑的作用原理是什么？

在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，靶蛋白會被可將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特定位點的蛋白激酶磷酸化。這些磷酸基團(tuán)在細(xì)胞裂解時會被內(nèi)源性蛋白磷酸酶去除。磷酸酶抑制劑有助于在細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)提取過程中保持磷酸蛋白的活性和狀態(tài)。

常用的蛋白酶抑制劑有哪些？

常見的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶，常用的磷酸酶抑制劑如下：

1. 氟化鈉（sodiμm fluoride）：酸性磷酸酶可逆抑制劑；

2.焦磷酸鈉（sodiμm pyrophosphate）：絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶不可逆抑制劑；

3.β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）：絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可逆抑制劑；

4.正釩酸鈉（sodiμm orthovanadate）：堿性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制劑：

5.鉬酸鈉（sodiμm molybdate）：酸性磷酸酶不可逆抑制劑；

6.二水酒石酸鈉（sodiμm tartrate dihydrate）：酸性磷酸酶可逆抑制劑；

7. 咪唑（imidazole）：堿性磷酸酶可逆抑制劑。