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磷酸化蛋白WB實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

蛋白磷酸化

細(xì)胞信號傳導(dǎo)活動是由一系列蛋白傳遞鏈構(gòu)成的，信號傳導(dǎo)的過程中涉及到多種蛋白質(zhì)可逆磷酸化過程。蛋白質(zhì)通過可逆磷酸化，以及不同的級聯(lián)反應(yīng)將信號放大傳遞。蛋白磷酸化是蛋白激酶在靶蛋白的氨基酸殘基上添加磷酸基團(tuán)的一種可逆的翻譯后修飾。蛋白質(zhì)磷酸化對于許多生物現(xiàn)象的引發(fā)是很必要的，包括細(xì)胞生長、增殖、泛素介導(dǎo)的蛋白降解等過程。

Western Blot 是檢測磷酸化蛋白質(zhì)的重要實(shí)驗(yàn)方法，然而磷酸化蛋白可能僅占細(xì)胞總蛋白中的一小部分，處理不得當(dāng)時(shí)還會快速的去磷酸化。磷酸化蛋白質(zhì) WB 做不好的原因有許多，比如封閉問題、抗體問題、或所需的磷酸化蛋白可能不存在于樣品中或者低于 WB 檢測量?？偨Y(jié)了以下操作事項(xiàng)，供大家在做磷酸化蛋白的時(shí)候參考，希望對實(shí)驗(yàn)中有所幫助。

1.確定樣本中磷酸化蛋白的表達(dá)量

正常情況下樣本的磷酸化水平過低或不表達(dá)，需要通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行一定的刺激和誘導(dǎo)，不同蛋白刺激條件各不相同，刺激的時(shí)間和強(qiáng)度需要根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定，可以利用PhosphoSitePlus數(shù)據(jù)庫（https://www.phosphosite.org）查詢蛋白的磷酸化情況。

2.冰上操作

樣本一旦開始裂解，蛋白水解、去磷酸化和變性也隨即開始。在做磷酸化蛋白的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都要保證低溫環(huán)境，始終將樣品置于冰上或維持在 4 °C，并在一開始就向裂解緩沖液中新鮮加入合適的抑制劑，能夠顯著減緩上述反應(yīng)。

3.使用磷酸酶抑制劑

由于蛋白的磷酸化是可逆的，組織或細(xì)胞裂解時(shí)會釋放出大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，導(dǎo)致不同于正常生理狀態(tài)的差異。因此，在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，對于維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)非常重要，否則可能導(dǎo)致條帶很淺或者沒有條帶。此外，樣品中或其它試劑中帶的細(xì)菌也會分泌外源性的磷酸酶，所以另一個(gè)關(guān)鍵是要盡量使用無菌清潔的試劑和凝膠。

4.優(yōu)化封閉條件

一般的WB實(shí)驗(yàn)中，我們通常使用 5 % 脫脂牛奶的TBST或著 5 % BSA 的TBST 室溫封閉1 h。但值得注意的是，脫脂牛奶是許多種蛋白質(zhì)的混合物，其中含有酪蛋白，是一種磷蛋白。如果我們的目標(biāo)蛋白為磷酸化蛋白的話，救千萬不要選擇脫脂奶粉，否則會有很多背景信號。另外應(yīng)避免膜封閉時(shí)間過長，防止掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。

5.檢測總蛋白含量

在檢測磷酸化蛋白同時(shí)，往往也需要檢測總蛋白。僅僅檢測到磷酸化蛋白表達(dá)量的升高或降低并不能說明問題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值增加或減少了才能說明磷酸化水平的變化。絕大部分情況下磷酸化和總蛋白的條帶位置基本是一樣的，我們常規(guī)的做法是在做完磷酸化抗體后，將膜 Strip 后再孵育總蛋白抗體。

但是在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過程中，讓?擔(dān)?影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的就是stripping/Reprobing 環(huán)節(jié)了。要閉著眼睛剝離抗體，誰也不確定磷酸化?抗有沒有剝離?凈；也不知道會不會把?標(biāo)蛋?也?起洗掉了。那么這種情況下，多?熒光就是磷酸化WB實(shí)驗(yàn)很好?個(gè)選擇了。通常會使??種熒光標(biāo)記的抗體雜交磷酸化蛋?；同時(shí)，使?另外?種熒光標(biāo)記的抗體雜交總蛋?（磷酸化和?磷酸化），然后通過不同熒光信號通道對磷酸化及總蛋?進(jìn)?區(qū)分。這樣就可以避免抗體剝離/重雜交的步驟，也避免了對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

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6. 4℃過夜孵育一抗

4℃抗體孵育條件非常重要。因?yàn)榭乖贵w之間是一種非共價(jià)的結(jié)合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗體，這種物理吸附在高溫下會變?nèi)?，容易脫落。其次要保證抗原和抗體相互磨合孵育的時(shí)間，磷酸化蛋白只占總量的極少部分，過夜可保證充分結(jié)合進(jìn)而曝出更漂亮的條帶。重要的之一，抗體質(zhì)量一定要好?。?！