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熱循環(huán)儀特點--6項關(guān)鍵考慮因素

不同型號和生產(chǎn)廠商的熱循環(huán)儀可能會展現(xiàn)出不同的性能和可重復性。 這些不同不僅會影響PCR效率也會對獲取數(shù)據(jù)的準確性和一致性造成影響。 過度使用的熱循環(huán)儀的可靠性，以及當問題出現(xiàn)時可提供的支持，都是在進行熱循環(huán)儀選擇時需要考慮的重要方面。 因此，了解可影響PCR結(jié)果的熱循環(huán)儀特點可幫助我們大程度實現(xiàn)實驗的成功。

1. 加熱模塊之間準確而一致的溫度

熱循環(huán)儀溫度的準確性可能會對PCR的成敗與否起決定性作用，因為PCR的三個主要步驟都依賴于溫度。 類似地，加熱模塊上孔與孔之間的溫度一致性對于獲取可靠而可重復的PCR結(jié)果也是至關(guān)重要的。 因此，所使用的熱循環(huán)儀能在模塊之間準確到達設(shè)定的溫度并具有一致性十分關(guān)鍵。

確保熱準確性的一種方法就是經(jīng)常使用溫度驗證試劑盒進行檢測（圖1）并根據(jù)需要由接受過培訓的專業(yè)人士進行重新校準。 溫度驗證檢測通?？捎糜冢?/span>

在等溫模式下相對于設(shè)定溫度的孔間準確性

在溫度轉(zhuǎn)換后相對于設(shè)定溫度的孔間準確性

熱蓋溫度的準確性（可影響模塊和樣品溫度）

圖 1. 使用溫度驗證試劑盒進行模塊和熱蓋溫度的測量

2. 用于引物退火優(yōu)化的精確溫度控制

梯度溫度控制是熱循環(huán)儀一項可有助于PCR中引物退火優(yōu)化的功能。 梯度設(shè)定的目的是在模塊之間實現(xiàn)變化的溫度，通過每列之間≥2°C的間隔溫度升降，使得可同時對于一系列的溫度進行測試以獲取較好的引物退火溫度（圖2A）。

理論上，真正的梯度可在模塊之間實現(xiàn)線性的溫度（圖2B）。 然而，梯度熱循環(huán)儀通常只采用單一的熱模塊并通過位于兩端的兩個加熱及冷卻元件進行溫度的控制。 該設(shè)計經(jīng)常會導致以下限制：

僅能設(shè)置兩個溫度：在熱模塊的兩端設(shè)置成引物退火的高、低極限溫度（圖2A）。 因此，無法在模塊間實現(xiàn)其他溫度的精準設(shè)置。

由于不同列之間的熱交換，模塊上不同區(qū)域之間的溫度更可能遵循的是S形的曲線變化而非真正的線性梯度（圖2B）。

圖 2. 梯度溫度設(shè)置 (A) 因為加熱模塊的設(shè)計，僅能設(shè)置兩個溫度：在熱模塊的兩端設(shè)置成引物退火的高、低極限溫度。 兩個溫度點的設(shè)置是基于計算出來的退火溫度（Tm）和不同列之間期望實現(xiàn)的溫度差異。 (B) 理論值（真正的梯度） vs. 梯度熱模塊上實際測量得到的溫度。

具有“better-than-gradient”技術(shù)的熱循環(huán)儀可實現(xiàn)更好的引物退火溫度控制[5]。 該技術(shù)的一種形式便是設(shè)計帶有三個或更多分割金屬模塊的熱循環(huán)儀，每一模塊都具有獨立的加熱和冷卻元件。 相比于梯度模塊，該模塊設(shè)計可帶來：

獨立設(shè)置三種或更多不同溫度的能力，以便使得每個獨立的區(qū)域都能進行更好的溫度控制，特別是在優(yōu)化過程中（圖3A）。

獨立金屬模塊的絕熱性阻止了模塊之間的熱交換。 這就可實現(xiàn)更為精準的模塊溫度控制，確保模塊之間實現(xiàn)真正線性的溫度變化（圖3B）。

圖 3. (A) 具有Applied Biosystems VeriFlex “better-than-gradient”技術(shù)的熱循環(huán)儀模塊可實現(xiàn)更為精準的溫度控制。 (B) VeriFlex模塊上設(shè)置為4°C溫度間隔差的6塊獨立區(qū)域的溫度測量

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3. 獲得準確的樣品溫度： 升降溫速度，維持時間及算法

熱循環(huán)儀對于樣品溫度控制的能力對于PCR檢測結(jié)果的準確性和整體性能十分重要。 儀器特異性的參數(shù)如升降溫速度，維持時間以及算法對于預測樣品溫度（包括模塊溫度都是準確控制樣品溫度的關(guān)鍵。

熱循環(huán)儀的升降溫速度意味著在一定時間內(nèi)發(fā)生的PCR步驟之間的溫度變化，并通過用攝氏度每秒(°C/sec)作為單位。 相應(yīng)的“升溫”和“降溫”分別代表著熱模塊的加熱和冷卻過程。

由于熱量從模塊傳輸至樣品需要一定的時間，樣品實際的升降溫速度會較慢（相對于模塊）。 因此，對于變溫速度的定義需要進行區(qū)分和了解（圖4）。

大的或峰值模塊升降溫速度代表在進行升降溫過程中非常小的一段時間內(nèi)模塊可以達到的很快溫度變化。

平均模塊升降溫速度代表在一段更長的時間內(nèi)溫度變化的速度，對于熱循環(huán)儀的速度會提供一種更具代表性的測量。

大樣品升降溫速度及平均樣品升降溫速度反映的是樣品實際獲得的溫度。 因此，樣品升降溫速度會為熱循環(huán)儀的性能以及其對于PCR結(jié)果的潛在影響提供一種更為準確的比較。

由于熱循環(huán)儀的升降溫速度會對PCR結(jié)果產(chǎn)生影響，當進行熱循環(huán)儀更換時，推薦使用帶有可模擬之前模式升降溫速度程序的儀器以實現(xiàn)更為簡易的更換并對PCR的重復性產(chǎn)生很小的影響。

圖 4. 模塊和樣品的升降溫速度 模塊的熱過沖可讓樣品更快達到期望的溫度。 橙色和藍色散點曲線描繪了在沒有模塊熱過沖的情況下模塊和樣品的溫度。

熱循環(huán)儀應(yīng)該被設(shè)計成只有樣品達到設(shè)置的溫度后才對相應(yīng)的步驟開始計時。 這樣維持時間，或樣品維持在設(shè)定溫度的時間，將會與操作流程中要求的相應(yīng)循環(huán)條件保持得更加準確。

熱循環(huán)儀通常會使用復雜的數(shù)學算法來確保樣品可按照預設(shè)程序快速地達到設(shè)置的溫度。[6] 根據(jù)反應(yīng)體系的體積以及所使用的PCR塑料耗材的厚度，算法可對樣品的溫度以及達到設(shè)置溫度所需的時間進行預測。 依靠這些算法，熱循環(huán)儀在加熱或冷卻的過程中，通常會通過一個叫做熱模塊過沖或下沖的過程讓模塊溫度超出設(shè)定值。 這樣的設(shè)置可以確保樣品盡快達到設(shè)定的溫度，而自身不會發(fā)生過沖或下沖（圖4）。

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4. 滿足不同實驗通量的靈活性及設(shè)計

在一定時間內(nèi)可以在熱循環(huán)儀內(nèi)進行的反應(yīng)數(shù)對于PCR實驗的效率十分重要。 可提升熱循環(huán)儀通量的因素包括升降溫速度、熱模塊構(gòu)造以及自動化平臺的整合。

熱循環(huán)儀的升降溫速度代表了其達到設(shè)置溫度的速度。 升降溫速度越快，PCR運行的速度就會越快，也就是在一定時間內(nèi)可以完成更多的實驗（圖5A）（了解更多：樣品升降溫速度 vs. 模塊升降溫速度）。 此外，使用可更快合成目標DNA的DNA聚合酶也可對高通量實驗進行加速（圖5B）。

圖 5. 熱循環(huán)儀的升降溫速度以及DNA聚合酶的合成速度影響PCR運行時間。 (A) 升降溫速度越快，升降溫時間越短。 在較低的升降溫速度（如1–3°C/秒）時，PCR運行時間的影響更為顯著。 該案例中使用的均為假設(shè)值，循環(huán)時間指的是操作流程時間。 (B)使用具有更快合成速度的DNA聚合酶將會導致更短的循環(huán)時間和PCR運行時間。

熱循環(huán)儀模塊的設(shè)計對于PCR實驗的設(shè)置也至關(guān)重要。 例如，可替換的模塊就可為每輪運行帶來樣品數(shù)量上的靈活性。 此外，具有可單獨控制的多個模塊的加熱模塊是在一臺熱循環(huán)儀上同時運行不同PCR程序的理想選擇（圖6）。

對于自動化的高通量PCR，熱循環(huán)儀應(yīng)該可編程并兼容控制移液處理系統(tǒng)的軟件。 自動化系統(tǒng)是進行高通量PCR反應(yīng)的理想選擇，因為其可以在幾乎沒有人為干預的情況下持續(xù)不斷地運行，因而將手工實驗設(shè)置所需的時間小化，并提高在一定時間內(nèi)可反應(yīng)的數(shù)量。 因此，對于比較簡易而靈活的自動化平臺進行整合的需求是存在的，從而實現(xiàn)移液處理或板堆疊的完全自動化操作。

5. 熱循環(huán)儀的可靠性，耐久性及質(zhì)量保證

除了性能和通量能力外，熱循環(huán)儀也應(yīng)當能夠承受一定的重復使用、環(huán)境壓力以及運輸條件。 一些生產(chǎn)廠商可能會對儀器如何進行可靠性和耐久性的檢測進行過報道[8]。 相應(yīng)的熱循環(huán)儀檢測包括：

組件可靠性： 機械裝備會被用于對經(jīng)常使用的儀器組件如熱蓋、控制面板/觸摸屏以及溫度循環(huán)模塊進行重復的測試（圖7A）。

環(huán)境壓力： 可使用環(huán)境艙來模擬常規(guī)實驗的不同條件，如溫度、濕度以及海拔（圖7B）。

運輸檢測： 可根據(jù)國際安全運輸協(xié)會（ISTA)標準進行激烈的沖擊和振動檢測，以確保儀器可在無受損的工作條件下運達（圖7C）。

圖 6. 具有三種獨立可控模式的熱循環(huán)儀模塊

6. 維護熱循環(huán)儀的質(zhì)保和服務(wù)

盡管有嚴格的可靠性和耐久性測試，熱循環(huán)儀在儀器的使用壽命周期內(nèi)仍然不可避免地會存在技術(shù)性問題。 為了消除后顧之憂，在進行購買儀器時應(yīng)該考慮由銷售商所提供的相關(guān)服務(wù)。 

總之，熱循環(huán)儀的特點如性能、設(shè)計、可靠性以及可獲得的支持和服務(wù)，是選擇PCR儀器需要考慮的重要因素。