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該技術(shù)也憑借其出色的靈敏度和特異性、精確性，在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面得到了廣泛的應(yīng)用。

數(shù)字PCR方法通常包括制備樣品(即提取核酸)、建立PCR 混合液、PCR混合液的分隔、通過熱循環(huán)進(jìn)行目標(biāo)擴(kuò)增、計算分隔的數(shù)目，根據(jù)終點熒光信號將每個分隔分為陽性群和陰性群，陽性微滴意味著至少含有1個DNA或cDNA分子，分析軟件根據(jù)每個樣品中陰性微滴/總微滴的數(shù)目，并使用泊松統(tǒng)計和已知的分隔體積計算出靶分子的濃度(copies/uL)。

為了保障數(shù)字PCR檢測的準(zhǔn)確度，操作者需要對反應(yīng)流程的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行準(zhǔn)確把控，如下：

1、樣本質(zhì)量：樣本的純度、完整性和濃度會影響數(shù)字 PCR 的結(jié)果。不純的樣本可能含有抑制物或干擾物質(zhì)，從而影響 PCR 反應(yīng)的效率和準(zhǔn)確性。同時確保模版濃度適中，避免過高或過低。

2、引物和探針的設(shè)計：引物和探針的特異性、長度和序列會影響數(shù)字 PCR 的準(zhǔn)確度。不合適的引物和探針可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增或錯配，從而影響定量結(jié)果。

3、反應(yīng)條件：PCR 反應(yīng)的溫度、時間和循環(huán)數(shù)等條件會影響數(shù)字 PCR 的結(jié)果。具備反應(yīng)條件優(yōu)化性能的設(shè)備能夠提供更精準(zhǔn)的實驗結(jié)果。BIO-RAD具有分體式數(shù)字PCR系列產(chǎn)品，可對PCR 反應(yīng)過程進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化。

4、儀器性能：數(shù)字 PCR 儀器的精度、靈敏度和穩(wěn)定性會影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。儀器的校準(zhǔn)和維護(hù)對確保準(zhǔn)確的定量結(jié)果至關(guān)重要。BIO-RAD數(shù)字PCR自2011年上市以來，多款產(chǎn)品以其專有的微流控技術(shù)及流式檢測技術(shù)，提供卓越的準(zhǔn)確性與靈敏度。

5、數(shù)據(jù)分析方法：數(shù)字 PCR 數(shù)據(jù)的分析方法也會影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。合適的數(shù)據(jù)處理和閾值設(shè)定可以提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

6.、操作誤差：實驗操作中的誤差，如加樣誤差、試劑混合不均勻等，也可能對數(shù)字 PCR 的結(jié)果產(chǎn)生影響。為了提高數(shù)字 PCR 的準(zhǔn)確度，需要注意樣本處理、引物和探針設(shè)計、反應(yīng)條件優(yōu)化、儀器性能和數(shù)據(jù)分析等多個方面，并采取適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制措施來減少誤差的影響。

數(shù)字PCR通常用于微量樣本的檢測，其檢測限也至關(guān)重要。檢測限( limit of detection,LOD)即可檢測到的分析物的Z低含量，可理解為從背景或陰性質(zhì)控中目標(biāo)核酸分子能夠統(tǒng)計性地分辨的Z小數(shù)量。確定LOD，需要測量一系列含有極低水平分析物的樣品。

數(shù)字 PCR 技術(shù)的檢測下限（LOD）會因不同的數(shù)字 PCR 系統(tǒng)、實驗條件和目標(biāo)分子而有所差異。一般來說，數(shù)字 PCR 技術(shù)的檢測下限可以達(dá)到單分子水平。

然而，需要注意的是，檢測下限的實際數(shù)值可能會受到實驗設(shè)計、樣本質(zhì)量和操作技巧等因素的影響。因此，在進(jìn)行數(shù)字 PCR 檢測限測定實驗時，通常需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和驗證，以確定特定實驗條件下的檢測下限。